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分享一下關(guān)于質(zhì)粒的分離操作方法

更新時間:2020-05-08      點擊次數(shù):998
  今天跟大家分享一下關(guān)于質(zhì)粒的分離操作方法,下面讓我們一起來了解一下吧。
 
  從細菌中分離質(zhì)粒 DNA 的具體操作
 
  材料設(shè)備試劑
 
  一、材料
 
  含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株,1.5ml塑料離心管(又稱eppendorf管),離心管架。
 
  二、設(shè)備
 
  微量取液器(20μl,200μl,1000μl),臺式高速離心機,恒溫振蕩搖床,高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋),渦旋振蕩器,電泳儀,瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。
 
  三、試劑
 
  1、LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani):稱取蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeastextract)5g,NaCl10g,溶于800ml去離子水中,用NaOH調(diào)pH至7.5,加去離子水至總體積1升,高壓下蒸氣滅菌20分鐘。
 
  2、LB固體培養(yǎng)基:液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉,高壓滅菌。
 
  3、氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)母液:配成50mg/ml水溶液,-20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 
  4、溶菌酶溶液:用10mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。
 
  5、3mol/lNaAc(pH5.2):50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O,用冰醋酸調(diào)pH至5.2,加水定容至100ml,分裝后高壓滅菌,儲存于4℃冰箱。
 
  6、溶液1:50mmol/L葡萄糖,25mmol/ L T r i s. Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱。
 
  7、溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋),1%SDS。
 
  8、溶液Ⅲ:5mol/LKAc60ml,冰醋酸11.5ml,H2O28.5ml,定容至100ml,并高壓滅菌。溶液終濃度為:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。
 
  9、RNA酶A母液:將RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加熱15分鐘,使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5mleppendorf管分裝成小份保存于-20℃。
 
  10、飽和酚:市售酚中含有醌等氧化物,這些產(chǎn)物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián),應(yīng)在160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羥基喹啉(作為抗氧化劑),并用等體積的0.5mol/LTris·Cl(pH8.0)和0.1mol/LTris·Cl(pH8.0)緩沖液反復(fù)抽提使之飽和并使其pH值達到7.6以上,因為酸性條件下DNA會分配于有機相。
 
  11、氯仿:按氯仿:異戊醇=24:1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開,異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。按體積/體積=1:1混合上述飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很強的腐蝕性,操作時應(yīng)戴手套。
 
  12、TE緩沖液:10mmo/LTris·Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。高壓滅菌后儲存于4℃冰箱中。
 
  13、STET:0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris·Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0),5%TritonX-100。
 
  14、STE:0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris·Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。
 
  15、電泳所用試劑:⑴TBE緩沖液(5×):稱取Tris54g,硼酸27.5g,并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml,定溶至1000ml。⑵上樣緩沖液(6×):0.25%溴酚藍,40%(w/v)蔗糖水溶液。
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